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羅氏公司TUNEL細胞凋亡檢測程序

發布人:浩然生物 瀏覽 24929次【字號 】 發布時間:2011年05月12日 打印本頁

羅氏公司TUNEL細胞凋亡檢測程序(In situ cell death detection kit-POD法)

一、 原理:
TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素(fluorescein)標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端,并與連接辣根過氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的熒光素抗體特異性結合,后者又與HRP底物二氨基聯苯胺(DAB)反應產生很強的顏色反應(呈深棕色),特異準確地定位正在凋亡的細胞,因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞;由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂,因而沒有3‘-OH形成,很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本(石蠟包埋、冰凍和超薄切片)和細胞樣本(細胞涂片)在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價,以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。
二、 器材與試劑
器材:光學顯微鏡及其成像系統、小型染色缸、濕盒(塑料飯盒與紗布)、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的加樣器及槍頭等;
試劑:試劑盒含TdT 10×、熒光素標記的dUTP 1×、標記熒光素抗體的HRP;自備試劑:PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(臨用前配制,5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8)或細胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,臨用前配制)、蘇木素或甲基綠、DNase 1(3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,pH 7.5, 10 mM MgCl2,1 mg/ml BSA)等。
三、 實驗步驟
操作流程圖:制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照。
具體操作步驟:
1. 用二甲苯浸洗2次,每次5min;
2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;
3. PBS漂洗2次;
4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C(溫度、時間、濃度均需摸索)或者加細胞通透液8min;
5. PBS漂洗2次;
6. 制備TUNEL反應混合液,處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標記的dUTP液混勻;而陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液,陽性對照組先加入100μl DNase 1,反應在15~25℃×10min,后面步驟同處理組。
7. 玻片干后,加50μl TUNEL反應混合液(陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液)于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1h。
8. PBS漂洗3次;
9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞(激發光波長為450~500nm,檢測波長為515~565nm);
10. 玻片干后加50μl converter-POD于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。
11. PBS漂洗3次;
12. 在組織處加50~100μlDAB底物,反應15~25℃×10min;
13. PBS漂洗3次;
14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復染,幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。
15. 加一滴PBS或甘油在視野下,用光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200~500個細胞)并拍照?山Y合凋亡細胞形態特征來綜合判斷(未染色細胞變小,胞膜完整但出現發泡現象,晚期出現凋亡小體,貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落;而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質分割成塊狀/凋亡小體)
四、 注意事項
1. 進行PBS 清洗時,每次清洗5 min。
2. PBS清洗后,為了各種反應的有效進行,請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應。
3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后,請蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進行,這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。
4. TUNEL反應液臨用前配制,短時間在冰上保存。不宜長期保存,長期保存會導酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配制。
6. 用甲基綠(Methyl Green)染液(3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0)染色后,請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈(100%乙醇)、脫水(二甲苯)透明、封片后通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時,甲基綠比較容易脫色,注意快速進行脫水操作。
7. 熒光素標記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物,可通過吸入、口服等途徑進入機體,注意防護。
8. 試劑保存;未打開的試劑


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